提供商:             上海研謹(jǐn)生物
服務(wù)名稱:           western blot服務(wù)
規(guī)格:               實(shí)驗(yàn)服務(wù) 
 
實(shí)驗(yàn)步驟:
一、試劑準(zhǔn)備
1. SDS-PAGE試劑: 見聚丙烯酰.胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。
2.勻漿緩沖液: 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml; 10%SDS 6.0 ml; β-巰基Z醇0.2 ml; ddH2O 2.8 ml.
3.轉(zhuǎn)膜緩沖液:甘氨酸29g; Tris5.8g; SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH20定容至1000 ml.
4.0.01 M PBS(pH7.4): NaCl8.0g; KC10.2 g; Na2HPO4 1. 44 g; KH2PO4 0.24 g;加ddH20至1000ml。
5.膜染色液:考馬斯亮蘭0.2g;甲醇80 ml;乙酸2 ml; ddH2O118 ml。 包被液(5%脫脂奶粉，現(xiàn)配) :脫脂奶粉1.0 g溶于20 m的0.01 M PBS中。
6.顯色液: DAB 6.0 mg; 0.01 M PBS 10.0ml; 硫酸鎳胺0.1 ml; H202 1.0 μl。
 
二、蛋白樣品制備
1.單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
(1)倒掉培養(yǎng)液， 并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡会徥箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。
(2)每瓶細(xì)胞加3 ml 4°C預(yù)冷的PBS (0.01M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動(dòng)1 min洗滌細(xì)胞,然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次,共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
(3)按1m裂解液加10 μl PMSF (100 mM)，搖勻置于冰上。(PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。)
(4)每瓶細(xì)胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。
(5)裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動(dòng)作要快)， 然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mI離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰 上進(jìn)行。)
(6)于4°C下12000 rpm離心5 min。(提前開離心機(jī)預(yù)冷)
(7)將離心后的.上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 m的離心管中放于- 20°C保存。
 
2.組織中總蛋白的提取
(1)將少量組織塊置于1 ~ 2 m勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
(2)加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
(3)幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上， 要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
(4)裂解30 min后,即可用移液器將裂解液移至1.5 mI離心管中,然后在49C下12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 mI離心管中并置于- 20°C保存。
 
3.加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落 下來，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取:
(1)將培養(yǎng)液倒至15 m|離心管中，于2500 rpm離心5 min.
(2)棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌--次。
(3)用槍洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF) 冰上裂解30 min,裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
(4)將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起49C、 12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 mI離心管中并置于- 20C保存。
 
三、蛋白含量的測定
1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
(1) 從- 20°C取出1 mg/ml BSA, 室溫融化后,備用。
(2)取18個(gè)1.5 mI離心管, 3個(gè)-組，分別標(biāo)記為0 mg, 2.5mg, 5.0mg，10.0 mg, 20.0mg， 40.0mg。
(3)按下表在各管中加入各種試劑。
(4)混溝后， 室溫放置2 min。在生物分光光度計(jì)(Bio-Photometer, Eppendorf). 上比色分析。
 
2.檢測樣品蛋白含量
(1)取足量的1.5 m離心管，每管加入4°C儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml。 室溫放置30 min后即可用于測蛋白。
(2)取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCI容液100 ml,混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。
(3)空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用無菌水洗- -次。
(4)取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15 mol/L NaCI NaCI溶液和5 mI待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min, 倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。
 
注意:每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無水Z醇洗2次，無菌水洗- -次。 可同時(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測，
這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測得的結(jié)果是5 mI樣品含的蛋白量。
 
四、SDS- PAGE電泳
1.清洗玻璃板
--只手扣緊玻璃板,另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
 
2.灌膠與上樣
(1)玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。(操作時(shí)要 使兩玻璃對齊以免漏膠。)
(2)按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10 m槍吸取5 m膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。(灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠-定要沿玻璃板流下， 這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。)
(3)當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)， 說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
(4)按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待
到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
(5)用水沖洗-下濃縮膠，將其放入電泳槽中。(小玻璃板面向內(nèi)， 大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另- -邊要墊一塊塑料板且有字的- -面面向外。)
(6)測完蛋白含量后，計(jì)算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 m離心管中，加入5xSDS.上樣緩沖液至終濃度為1x。( 上樣總體積-般不超過15 μl,加樣孔的最大限度可加20 μ樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。
(7)加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。(電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。 )用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣 品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下-個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。
 
3.電泳
電泳時(shí)間一般4 ~5h,電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
 
五、轉(zhuǎn)膜
1.轉(zhuǎn)一 張膜需準(zhǔn)備6張7.0~ 8.3 cm的濾紙和1張7.3 ~ 8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)-定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。(用鑷子捏住膜的- 邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸
濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一-層空 氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。
2.在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤 里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、-支玻棒、濾紙和浸過的膜。
3.將夾子打開使黑的一 面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上)，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。
4.要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬-會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。(撬時(shí)一 定要小心，玻板很易裂。)除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作)，要避免把分離膠刮破。 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，手調(diào)整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠(膜蓋下后不可再移動(dòng))并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。(轉(zhuǎn)移液含甲醇， 操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。)
5.將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h. .
6.轉(zhuǎn)完后將膜用1x麗春紅染液染5 min (于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。
 
六免疫反應(yīng)
1.將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。
2. 將抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度(在1.5 m離心管中) ;撕下適當(dāng)大小的-塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡;室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗-次，10 min.
3.同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1 ~2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗- -次， 10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
 
七、化學(xué)發(fā)光,影，定影
1.將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合; 1 min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸; 1 min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液，包好,放入X-光片夾中。
2. 在暗室中,將1x顯影液和定影液分別到入塑料盤中;在紅燈下取出X -光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大小(比膜的長和寬均需大1 cm) ;打開X-光片夾，把X -光片放在膜上，- 旦放上,便不能移動(dòng)，關(guān)上X光.陜，開始計(jì)時(shí);根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，-般為1 min或5 min,也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)zui佳效果;曝光完成后，打開X-光片夾， 取出X-光片, 迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間-般為1~2 min (20~ 25°C)，溫度過低時(shí)(低于16°C) 需適當(dāng)延長顯影時(shí)間;顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間-般為5 ~ 10 min,以膠片透明為止;用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。
應(yīng)注意的是:顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片,否則會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生影響。
 
八凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。
展開
 
注意事項(xiàng):
1.一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。
2.顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。
3. DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。
 
其他:
一、免疫反應(yīng)
1.用0.01 M PBS洗膜，5 min x3次。
2.加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2 h。
3.棄包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 minx3次。
4.加入一抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部)，49C 放置12 h以上。陰性對照，以1%BSA取代-抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
5.棄-抗和1%BSA,用0.01 M PBS分別洗膜，5 minx4次。
6.加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋)，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2 h。
7.棄二抗，用0.01 M PBS洗膜，5 minx4次。
8.加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。
 
 
 
 
 
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