人胰島細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法 產(chǎn)品編號：ISC2011H 產(chǎn)品名稱：人胰島細(xì)胞分離液試劑盒 本品用于分離人胰島細(xì)胞? 技術(shù)文檔編號：TBD0048SOP 【產(chǎn)品規(guī)格】 2×200ml/Kit 【產(chǎn)品組成】 為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下： 名稱 產(chǎn)品編號 規(guī)格 A 分離液 1 200ml B 分離液 2 200ml C 勻漿沖洗液（贈品） F2013TBD 200ml D 樣本稀釋液（贈品） 2010C1119 200ml E 清洗液（贈品） 2010X1118 200ml F 洗滌液（贈品） TBDTM-W 200ml G 說明書 1 份 【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】 1.適用儀器 最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī) 2.無菌硅化離心管 序號 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品貨號 規(guī)格 1 無菌硅化離心管/10ml（隨試劑盒附贈 5 支） TUB2015 100 支/包 【組織樣本的制備】 1.取組織塊稱重后，用眼科剪刀無菌操作，將組織剪成小塊。 2.將組織塊放在 70μm 細(xì)胞篩網(wǎng)（產(chǎn)品編號：TBDTM-SC，隨試劑盒附贈 5 個）上，用研磨器反復(fù)研磨，邊研磨邊加入勻漿沖洗液（以 0.1g 組織為例，約加 5-8ml），使細(xì)胞全部通過篩網(wǎng)滴到離心管中。 3.棄去篩網(wǎng)，組織研磨液經(jīng) 450g，離心 10min，棄上清。 4.用樣本稀釋液重懸組織細(xì)胞，將細(xì)胞懸液細(xì)胞濃度調(diào)整為 2×108–1×109/ml（以 0.1g 組織為例，約使用 1ml 樣本稀釋液重懸細(xì)胞），備用。 【檢驗(yàn)方法】 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。 1.取一支無菌硅化離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:2，試劑總量與稀釋后的樣本量相等，如組織單細(xì)胞懸液為 5ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：2ml），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。 2.用吸管小心吸取組織懸液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)組織懸液樣本量確定離心條件，樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。 3.離心后，此時離心管中由上至下分為五層。第一層為稀釋液層。第二層分離液 2 層。第三環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層。第四層為分離液 1 層。第五層為紅細(xì)胞層。 4.用吸管小心吸取第二層試劑 D 層和第三層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 5-10ml 洗滌液（產(chǎn)品編號：TBDTM-W），混勻細(xì)胞。 5.400g，離心 10min。 6.棄上清。 7.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。 8.250g，離心 10min。 9.重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。【差異貼壁法純化細(xì)胞】 （1）用胰島細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：TBD20180028）或胰島細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn) 品編號：TBD20180058）以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞 板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。 （2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。 （3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。 （4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。 注： a)無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。 b)完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。 c)由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。 【注意事項(xiàng)】 1.全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時間越長，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。 2.本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。 3.吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。 4.如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術(shù)以尋求幫助。 【儲存條件及有效期】 常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】 本實(shí)驗(yàn)胰島細(xì)胞提取率大于 80%。 【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】 1.組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。 2.所獲得胰島細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。 3.所獲得胰島細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。 4.所獲得胰島細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù) D.PCR 技術(shù) 【可能存在的問題及解決方法】 1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示： 出現(xiàn)情況 出現(xiàn)原因 建議解決方案 離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 離心后白環(huán)層彌散 細(xì)胞密度過大 調(diào)整細(xì)胞密度 離心后白環(huán)層太淺或看不見 細(xì)胞密度過小 2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。 3.本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。 注：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果， 離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。