魚外周血淋巴細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
 
本品用于分離魚(淡水)全血淋巴細(xì)胞
 
技術(shù)文檔編號：TBD0017SOP
 
【產(chǎn)品規(guī)格】
 
200ml/Kit
 
【產(chǎn)品組成】
 
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
 

	名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
A	XXXX 動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞分離液		200ml
B	樣本稀釋液（贈(zèng)品）	2010C1119	200ml
C	清洗液（贈(zèng)品）	2010X1118	200ml
D	說明書		1 份

 
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
 
適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
 
【檢驗(yàn)方法】
 
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
 
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）混勻，根據(jù)
 
稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：
 
情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 

• 取一支 15ml 離心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）。

 

• 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

 

• 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
• 250g，離心 10min。

 

• 棄上清。

 

• 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

• 250g，離心 10min。

 

• 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

 
情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 

• 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液。

 

• 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，550-650g（最大離心力可至 1000g），離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果。加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）。

 

• 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 9。

 
分離圖例
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
【注意事項(xiàng)】
 

• 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

 

• 本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

 

• 吸取過多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

 

• 吸取過多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

 

• 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請聯(lián)系上海研謹(jǐn)生物技術(shù)人員以尋求幫助。

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
 
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
 
【參考值（參考范圍）】
 
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
 

	紅細(xì)胞		白細(xì)胞		血小板
		（4.0-10.0）×109
含量（個(gè)/L）	（4.0-5.5）×1012	中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×1011
		50%-70%	20%-40%	3%-8%
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

 

• 所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

 

• 所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

 

• 所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)
 
D.PCR 技術(shù)
 
 

【可能存在的問題及解決方法】
1.	由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
	出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因		建議解決方案
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層		轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短		適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速
	離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長
	離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過大		調(diào)整細(xì)胞密度
	離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小
2.	本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地