可能影響酶免疫測定ELISA結果的標本內源性干擾因素

 
內源性干擾因素一般包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體、交叉反應物質等。在日常的臨床血清（漿）標本中，有相當比例不同程度的含有上述各種干擾物質，從而導致測定結果的假陽性。
1.類風濕因子（rheumatoid factors,RF）在類風濕患者、其他疾病以及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的RF，RF一般為TgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有與變性IgG產生非特異結合的特點，因為在ELISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結合，從而出現假陽性結果。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現最為明顯，因為此時固相包被的抗體為抗人弘鏈抗體，IgM型RF的存在可使其大量結合于固相。為避免RF對ELISA測定的干擾，通常可以采取下述措施：
(1)稀釋標本：這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體如抗HAVIgM，抗HBclgM， TORCH的IgM抗體檢驗等尤為有用。因為急性感染時，血循環中特異的IgM抗體滴度通常很高，而RF滴度通常相對要低得多。因此，在測定前對標本進行稀釋，特異的IgM因高滴度存在仍可檢出，而非特異的RF則會因為稀釋變成非常低的滴度，從而對測定幾乎不產生干擾。現在，有些特異IgM檢測ELISA試劑盒不要求稀釋標本，直接檢測，這樣雖然方便了實驗室技術人員的操作，但容易出現假陽性結果，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染，血循環中抗HBelgM可持續以一定的滴度存在，標本不做稀釋即進行檢測，即可出現陽性結果，從而失去抗HBclgM用于HBV急性感染的診斷價值。因此，在臨床實驗室，一定要使用要求對標本做1:1000稀釋的試劑盒進行檢驗，從而保證相應檢測項目結果的可靠性及臨床應用價值。
(2)改變酶標抗體：由于RF結合的是IgG的Fc片段，如果將待酶標的抗體的F，片段酶切夫除，僅留下具有特異結合功能的F(ab’)2部分標記酶，則在測定中即可避免RF的干擾。
(3)標本中RF用變性IgG預先封閉：將經熱變性（63℃，10min）的動物如兔、羊等的IgG加入到標本稀釋液中，或是將該變性IgG連接至一顆粒固相如聚苯乙烯微球或微孔，然后加入臨床血清標本，反應后，再吸出標本進行檢測。此外，在測定特異IgM時，也可使用抗人IgG去除臨床標本中RF和IgG。
(4)測定抗原時，可在標本中加入可使RF降解的還原劑：如2—巰基乙醇。2—巰基乙醇等還原劑可使抗體內的巰基裂解，因而可以去除RF的干擾，但只適用于抗原測定。
(5)包被或酶標二抗使用特異的雞抗體IgY：RF不與雞IgY反應，如果包被和酶標二抗均為雞IgY抗體，則不受標本中RF的干擾。
2.補體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相特異抗體和酶標二抗均有激活人補體系統的功能。一方面，固相抗體和酶標二抗可因為其在固相吸附及結合過程中，抗體分子發生變構，從而其F, 段的補體C1，結合位點被暴露出來，這樣C1，就成為一個中介物將二者交聯起來，從而出現假陽性結果。另一方面，固相抗體也會因為活化補體的結合，封閉抗體的抗原表位結合能力，而引起假陽性結果或使定量測定結果偏低。由補體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)對臨床血清標本加熱滅活補體：采用56~C30min加熱可使標本中的補體C1。滅活。
(2)包被或酶標二抗使用特異的雞抗體：雞抗體不激活人的補體系統，因此，使用特異的雞抗體，不會出現因補體激活而存在的假陽性和假陰性干擾。
3.異嗜性抗體（heterophilieantibodies）人類血清中含有抗嚙齒類動物（如鼠、馬、羊等）的免疫球蛋白（lg）的抗體，即天然的異嗜性抗體。有研究表明，天然的異嗜性抗體（lgG）可分為兩類，一類（85%的假陽性由其引起）可結合于山羊、小鼠、大鼠、馬和牛IgG的Fab區域，但不與兔IgG的Fab區結合。另一類（15%的假陽性由其引起）可結合于小鼠、馬、牛和兔IgG的Fc區表位，但不與山羊和大鼠IgG的Pc區表位結合。異嗜性抗體可通過交聯固相和酶標的單抗或多抗而出現假陽性反應。由異嗜性抗體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)使用特異的兔F(ab’)2。片段作為固相或測定酶標抗體。
(2)在標本或標本稀釋液中加入過量的動物Ig，封閉可能存在的異嗜性抗體。但加入量不足或亞類不同時無效。
(3)使用靶特異的非Ig親和蛋白（affibody）替代固相或酶標抗體之一。采用噬菌展示來自單個金黃色葡萄球A蛋白（SPA）聯合文庫的人IgA結合親和蛋白，用于IgA的測定，不受異嗜性抗體的影響。
4.因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體在臨床上，有嘗試使用鼠源性單克隆抗體進行靶向治療，及使用放射性核索標記鼠源性單克隆抗體進行影像診斷等，均有可能使相應患者體內產生抗鼠抗體。這種抗鼠抗體對使用鼠源性單克隆抗體的酶免疫測定，可產生假陽性結果。由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)使用的特異的抗體（F，。bf）:片段作為固相或測定酶標抗體。
(2)在標本或標本稀釋液中加入過量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體。
(3)使用特異的雞抗體IgG作為固相和測定抗體。雞IgG不與人抗鼠抗體反應。因而，用其作為固相或酶標抗體不會出現假陽性結果。
5.自身抗體   自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島索等，能與其相應靶抗原結果形成復合物，在ELISA方法中可干擾相應原抗體的測定。為避免以上情況出現，可在測定前用理化方法將其解離。
6. 溶菌酶溶菌酶可與等電點較低的蛋白有強的結合能力。免疫球蛋白等電點約為5，因此，在雙抗體夾心法ELISA測定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶標的IgG間形成橋接，從而導致假陽性。因此，為保證ELISA測定的可靠性，有必要從標本中去除溶菌酶或將其封閉，Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶，防止其連接IgG。
更多技術資料請查詢上海研謹生物：m.hehuantang.cc